QC必備的四大(dà)知(zhī)識闆塊
發布時間：2021-07-21
真正的分(fēn)析實驗員(yuán)一(yī)定是肚子裏有幹貨、有墨水哒！今天，爲小(xiǎo)夥伴們梳理幾組概念，不熟悉或者已然熟悉的小(xiǎo)夥伴不妨來看看。内容涵蓋分(fēn)離(lí)分(fēn)析導論、氣相色譜法、高效液相色譜法和質譜分(fēn)析法四大(dà)闆塊。
色譜法是一(yī)種分(fēn)離(lí)分(fēn)析方法。它利用樣品中(zhōng)各組分(fēn)與流動相和固定相的作用力不同（吸附、分(fēn)配、交換等性能上的差異），先将它們分(fēn)離(lí)，後按一(yī)定順序檢測各組分(fēn)及其含量的方法。當混合物(wù)随流動相流經色譜柱時，就會與柱中(zhōng)固定相發生(shēng)作用（溶解、吸附等），由于混合物(wù)中(zhōng)各組分(fēn)物(wù)理化學性質和結構上的差異，與固定相發生(shēng)作用的大(dà)小(xiǎo)、強弱不同，在同一(yī)推動力作用下(xià)，各組分(fēn)在固定相中(zhōng)的滞留時間不同，從而使混合物(wù)中(zhōng)各組分(fēn)按一(yī)定順序從柱中(zhōng)流出。這種利用各組分(fēn)在兩相中(zhōng)性能上的差異，使混合物(wù)中(zhōng)各組分(fēn)分(fēn)離(lí)的技術，稱爲色譜法。色譜分(fēn)離(lí)過程中(zhōng)攜帶組分(fēn)向前移動的物(wù)質。色譜分(fēn)離(lí)過程中(zhōng)不移動的具有吸附活性的固體(tǐ)或是塗漬在載體(tǐ)表面的液體(tǐ)。（1）分(fēn)離(lí)效率高，複雜(zá)混合物(wù)，有機同系物(wù)、異構體(tǐ)。（2）靈敏度高，可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物(wù)質量。（3）分(fēn)析速度快，一(yī)般在幾分(fēn)鍾或幾十分(fēn)鍾内可以完成一(yī)個試樣的分(fēn)析。（4）應用範圍廣，氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機或無機試樣的分(fēn)析。液相色譜：高沸點、熱不穩定、生(shēng)物(wù)試樣的分(fēn)離(lí)分(fēn)析。 (5) 高選擇性：對性質極爲相似的組分(fēn)有很強的分(fēn)離(lí)能力。不足之處：被分(fēn)離(lí)組分(fēn)的定性較爲困難。按兩相狀态分(fēn)類，按操作形式分(fēn)類，按分(fēn)離(lí)原理分(fēn)類。氣相色譜(Gas Chromatography, GC)，液相色譜(Liquid Chromatography, LC)，超臨界流體(tǐ)色譜 (Supercritical Fluid Chromatography, SFC)。氣相色譜：流動相爲氣體(tǐ)（稱爲載氣）。常用的氣相色譜流動相有N2、H2、He等氣體(tǐ)。按分(fēn)離(lí)柱不同可分(fēn)爲：填充柱色譜和毛細管柱色譜；按固定相的不同又(yòu)分(fēn)爲：氣固色譜和氣液色譜。按固定相的不同分(fēn)爲：液固色譜和液液色譜。超臨界流體(tǐ)色譜：流動相爲超臨界流體(tǐ)。超臨界流體(tǐ)是一(yī)種介于氣體(tǐ)和液體(tǐ)之間的狀态。超臨界流體(tǐ)色譜法是集氣相色譜法和液相色譜法的優勢而發展起來的一(yī)種新型的色譜分(fēn)離(lí)分(fēn)析技術，不僅能夠分(fēn)析氣相色譜不宜分(fēn)析的高沸點、低揮發性的試樣組分(fēn)，而且具有比高效液相色譜更快的分(fēn)析速率和更高的柱效率。柱色譜(Column Chromatography, CC)：固定相裝在柱管内；包括填充柱色譜和毛細管柱色譜。紙(zhǐ)色譜(Paper Chromatography, PC)固定相爲濾紙(zhǐ)；采用适當溶劑使樣品在濾紙(zhǐ)上展開(kāi)而進行分(fēn)離(lí)。薄層色譜(Thin Layer Chromatography, TLC)固定相壓成或塗成薄層；操作方法同紙(zhǐ)色譜。（3）按分(fēn)離(lí)原理分(fēn)類：吸附色譜(Absorption chromatography)；分(fēn)配色譜(Partition Chromatography)；離(lí)子交換色譜(Ion Exchange Chromatography)；凝膠色譜(Gel Chromatography)。組分(fēn)在檢測器上産生(shēng)的信号強度對時間(t)所作的圖，由于它記錄了各組分(fēn)流出色譜柱的情況，所以又(yòu)叫色譜流出曲線。流出曲線的突起部分(fēn)稱爲色譜峰。色譜保留值是色譜定性分(fēn)析的依據，它體(tǐ)現了各待測組分(fēn)在色譜柱上的滞留情況。在固定相中(zhōng)溶解性能越好，或與固定相的吸附性能越強的組分(fēn)，在柱中(zhōng)的滞留時間越長，或者說将組分(fēn)帶出色譜柱所需的流動相體(tǐ)積越大(dà)。所以保留值可以用保留時間和保留體(tǐ)積兩套參數來描述。根據色譜峰的數目，可判斷樣品中(zhōng)所含組分(fēn)的最少個數；根據色譜峰的保留值進行定性分(fēn)析；根據色譜峰的面積或峰高進行定量分(fēn)析；根據色譜峰的保留值和區域寬度評價色譜柱的分(fēn)離(lí)效能；根據兩峰間的距離(lí)，可評價固定相及流動相選擇是否合适。分(fēn)配比是指，在一(yī)定溫度下(xià)，組分(fēn)在兩相間分(fēn)配達到平衡時的質量比。11、在色譜流出曲線上，兩峰之間的距離(lí)主要由兩組分(fēn)在兩相間的分(fēn)配系數還是擴散速度決定？爲什麽？分(fēn)配系數。兩峰間的距離(lí)由熱力學因素決定，兩組分(fēn)在兩相中(zhōng)分(fēn)配系數差異越大(dà)，兩峰間的距離(lí)則相差越大(dà)，越容易被分(fēn)離(lí)。而擴散速度是動力學因素，反映在色譜流出曲線上即爲色譜峰的區域寬度（形狀）。色譜分(fēn)離(lí)過程的熱力學和動力學問題。影響分(fēn)離(lí)及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分(fēn)離(lí)度的評價指标及其關系。13、組分(fēn)保留時間爲何不同？色譜峰爲何變寬？組分(fēn)保留時間：色譜過程的熱力學因素控制；（組分(fēn)和固定液的結構和性質）。色譜峰變寬：色譜過程的動力學因素控制；（兩相中(zhōng)的運動阻力，擴散作用）。塔闆理論和速率理論分(fēn)别從熱力學和動力學的角度闡述了色譜分(fēn)離(lí)效能及其影響因素。将色譜分(fēn)離(lí)過程比拟作蒸餾過程，将連續的色譜分(fēn)離(lí)過程分(fēn)割成多次的平衡過程的重複（類似于蒸餾塔塔闆上的平衡過程）。塔闆理論引入了塔闆數和塔闆高度作爲柱效的衡量指标；不同物(wù)質在同一(yī)色譜柱上的分(fēn)配系數不同，用有效塔闆數和有效塔闆高度作爲衡量柱效能的指标時，應指明測定物(wù)質；柱效不能表示被分(fēn)離(lí)組分(fēn)的實際分(fēn)離(lí)效果，當兩組分(fēn)的分(fēn)配系數K相同時，無論該色譜柱的塔闆數多大(dà)，都無法分(fēn)離(lí)。塔闆理論的基本假設不符合色譜柱的實際分(fēn)離(lí)過程。塔闆理論無法解釋同一(yī)色譜柱在不同的流動相流速下(xià)柱效不同的實驗結果，不能說明色譜峰爲什麽會展寬，同時未能指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑和方法。A─渦流擴散項：A與流動相性質、流動相速率無關。要減小(xiǎo)A值，需要從提高固定相的顆粒細度和均勻性以及填充均勻性來解決。對于空心毛細管柱，A=0。固定相顆粒越小(xiǎo)dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現象減輕，色譜峰較窄。B/u —分(fēn)子擴散項：存在着濃度差，産生(shēng)縱向擴散；擴散導緻色譜峰變寬，H↑(n↓)，分(fēn)離(lí)變差;；分(fēn)子擴散項與流速有關，流速↓，滞留時間↑，擴散↑；擴散系數：Dg ∝(M載氣)-1/2 ；M載氣↑，B值↓。C ·u —傳質阻力項：dp↓， df↓, D ↑ ,可降低傳質阻力。由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在着一(yī)個最佳流速值，即速率方程式中(zhōng)塔闆高度對流速的一(yī)階導數有一(yī)極小(xiǎo)值。以塔闆高度H對應流速u作圖，曲線最低點的流速即爲最佳流速。組分(fēn)分(fēn)子在柱内運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分(fēn)子擴散及傳質阻力使兩相間的分(fēn)配平衡不能瞬間達到等因素是造成色譜峰擴展、柱效下(xià)降的主要原因；通過選擇适當的固定相粒度、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效；速率理論爲色譜分(fēn)離(lí)和操作條件選擇提供了理論指導。闡明了流速和柱溫對柱效及分(fēn)離(lí)的影響；各種因素相互制約，如載氣流速增大(dà)，分(fēn)子擴散項的影響減小(xiǎo)，使柱效提高，但同時傳質阻力項的影響增大(dà)，又(yòu)使柱效下(xià)降；柱溫升高，有利于傳質，但又(yòu)加劇了分(fēn)子擴散的影響。選擇最佳條件，才能使柱效達到最高。（1）與标樣對照的方法：利用保留值定性：通過對比試樣中(zhōng)具有與純物(wù)質相同保留值的色譜峰，來确定試樣中(zhōng)是否含有該物(wù)質及在色譜圖中(zhōng)的位置。不适用于不同儀器上獲得的數據之間的對比。利用加入法定性：将純物(wù)質加入到試樣中(zhōng)，觀察各組分(fēn)色譜峰的相對變化。（2）利用文獻保留值定性：利用相對保留值r21定性。相對保留值r21僅與柱溫和固定相性質有關。在色譜手冊中(zhōng)都列有各種物(wù)質在不同固定相上的保留數據，可以用來進行定性鑒定。（1）定量校正因子：試樣中(zhōng)各組分(fēn)質量與其色譜峰面積成正比，即：m i = fi’ ·Ai ；絕對校正因子：比例系數f i ，單位面積對應的物(wù)質量：f i ’ =m i / Ai ；相對校正因子f i ：即組分(fēn)的絕對校正因子與标準物(wù)質的絕對校正因子之比。①歸一(yī)化法：特點及要求：歸一(yī)化法簡便、準确；進樣量的準确性和操作條件的變動對測定結果影響不大(dà)；僅适用于試樣中(zhōng)所有組分(fēn)全出峰的情況。
②外(wài)标法——标準曲線法：特點及要求：外(wài)标法不使用校正因子，準确性較高，操作條件變化對結果準确性影響較大(dà)。對進樣量的準确性控制要求較高，适用于大(dà)批量試樣的快速分(fēn)析。
③内标法：内标物(wù)要滿足以下(xià)要求：（a）試樣中(zhōng)不含有該物(wù)質；（b）與被測組分(fēn)性質比較接近；（c）不與試樣發生(shēng)化學反應；（d）出峰位置應位于被測組分(fēn)附近，且能分(fēn)離(lí)開(kāi)；（e）加入量适中(zhōng)并與待測組分(fēn)接近。
内标法特點：内标法的準确性較高，操作條件和進樣量的稍許變動對定量結果的影響不大(dà)；每個試樣的分(fēn)析，都要進行兩次稱量，不适合大(dà)批量試樣的快速分(fēn)析；若将内标法中(zhōng)的試樣取樣量和内标物(wù)加入量固定，則：wi=Ai/As *常數。
要求樣品氣化，不适用于大(dà)部分(fēn)沸點高和熱不穩定的化合物(wù)，對于腐蝕性能和反應性能較強的物(wù)質更難于分(fēn)析。大(dà)約有15%-20%的有機物(wù)能用氣相色譜法進行分(fēn)析。氣路系統、進樣系統、分(fēn)離(lí)系統、檢測系統、溫控系統、記錄系統。包括氣源、淨化器和載氣流速控制；常用的載氣有：氫氣、氮氣、氦氣:。氣體(tǐ)進樣器（六通閥）：試樣首先充滿定量管，切入後，載氣攜帶定量管中(zhōng)的試樣氣體(tǐ)進入分(fēn)離(lí)柱；液體(tǐ)進樣器：不同規格的微量注射器，填充柱色譜常用10μL；毛細管色譜常用1μL；新型儀器帶有全自動液體(tǐ)進樣器，清洗、潤沖、取樣、進樣、換樣等過程自動完成，一(yī)次可放(fàng)置數十個試樣。分(fēn)流進樣：樣品在汽化室内氣化，蒸氣大(dà)部分(fēn)經分(fēn)流管道放(fàng)空，隻有極小(xiǎo)一(yī)部分(fēn)被載氣導入色譜柱；不分(fēn)流進樣：樣品直接注入色譜的汽化室，經過揮發後全部引入色譜柱。色譜柱：填充柱（2-6 mm直徑，1-5 m長），毛細管柱（0.1-0.5 mm直徑, 幾十米長）。溫度是色譜分(fēn)離(lí)條件的重要選擇參數，氣化室、色譜柱恒溫箱、檢測器三部分(fēn)在色譜儀操作時均需控制溫度。檢測器：保證被分(fēn)離(lí)後的組分(fēn)通過時不在此冷凝；色譜柱恒溫箱：準确控制分(fēn)離(lí)需要的溫度。作用：将色譜分(fēn)離(lí)後的各組分(fēn)的量轉變成可測量的電信号。檢測器類型：濃度型檢測器、熱導檢測器、電子捕獲檢測器、質量型檢測器、氫火(huǒ)焰離(lí)子化檢測器、火(huǒ)焰光度檢測器。結構簡單，穩定性好；對無機物(wù)和有機物(wù)都有響應，不破壞樣品；靈敏度不高。(3)氫焰檢測器具有結構簡單、穩定性好、靈敏度高、響應迅速、死體(tǐ)積小(xiǎo)、線性範圍寬等特點；(4)比熱導檢測器的靈敏度高出近3個數量級，檢測下(xià)限可達10-12g·g-1。(3)不能檢測永久性氣體(tǐ)、水及四氯化碳等。對鹵素、硫、磷、氮、氧有很強的響應；靈敏度高，可用于痕量農藥殘留物(wù)的分(fēn)析；線性範圍較窄。是一(yī)種對含硫、磷化合物(wù)具有高選擇性的檢測器。含硫、磷化合物(wù)在富氫火(huǒ)焰中(zhōng)燃燒被打成有機碎片，發出不同波長的特征光譜。液體(tǐ)固定相：由載體(tǐ)和固定液組成；聚合物(wù)固定相。一(yī)般爲固體(tǐ)吸附劑，常用的有活性炭，矽膠，氧化鋁和分(fēn)子篩。缺點：柱效低、吸附活性中(zhōng)心易中(zhōng)毒，使用前要進行活化。應用：主要用于惰性氣體(tǐ)、H2、O2、N2、CO、CO2和CH4等一(yī)般氣體(tǐ)和低沸點物(wù)質。16、作爲載體(tǐ)使用的物(wù)質應滿足的條件表面有微孔結構，孔徑均勻，比表面積大(dà)；化學和物(wù)理惰性，即與樣品組分(fēn)不起化學反應，無吸附作用或吸附很弱；熱穩定性好；有一(yī)定的機械強度和浸潤性，不易破碎；具有一(yī)定的粒度和規則的形狀，最好是球形。在使用溫度下(xià)是液體(tǐ)，具有較低的揮發性；具有良好的熱穩定性；對要分(fēn)離(lí)的各組分(fēn)應具有合适的分(fēn)配系數；化學穩定性好，不與樣品組分(fēn)、載氣、載體(tǐ)發生(shēng)任何化學反應。非極性固定液、中(zhōng)等極性固定液、強極性固定液、氫鍵型固定液。主要是一(yī)些飽和烷烴和甲基矽油，它們與待測物(wù)質分(fēn)子之間的作用力以色散力爲主。組分(fēn)按沸點由低到高順序流出，若樣品中(zhōng)兼有極性和非極性組分(fēn)，則同沸點的極性組分(fēn)先出峰。常用的固定液有角鲨烷（異三十烷）、阿皮松等。适用于非極性和弱極性化合物(wù)的分(fēn)析。由較大(dà)的烷基和少量的極性基團或可以誘導極化的基團組成，它們與待測物(wù)質分(fēn)子間的作用力以色散力和誘導力爲主，組分(fēn)基本上按沸點順序出峰，同沸點的非極性組分(fēn)先出峰。常用的固定液有鄰苯二甲酸二壬酯、聚酯等，适用于弱極性和中(zhōng)等極性化合物(wù)的分(fēn)析。含有較強的極性基團，它們與待測物(wù)質分(fēn)子間作用力以靜電力和誘導力爲主，組分(fēn)按極性由小(xiǎo)到大(dà)的順序出峰。常用的固定液有氧二丙腈等，适用于極性化合物(wù)的分(fēn)析。是強極性固定液中(zhōng)特殊的一(yī)類，與待測物(wù)質分(fēn)子間作用力以氫鍵力爲主，組分(fēn)依形成氫鍵的難易程度出峰，不易形成氫鍵的組分(fēn)先出峰。常用的固定液有聚乙二醇、三乙醇胺等，适用于分(fēn)析含F、N、O等的化合物(wù)。①按極性相似原則選擇：極性相似，溶解度大(dà)，分(fēn)配系數大(dà)，保留時間長；②按官能團相似選擇：酯類---酯或聚酯類固定液；醇類---聚乙二醇固定液；③按主要差别選擇：各組分(fēn)間沸點是主要差别----非極性固定液；極性爲主要差别----極性固定液；④選擇混合固定液：對于難分(fēn)離(lí)的複雜(zá)樣品，可選用兩種或兩種以上固定液。既可作爲固體(tǐ)固定相，也可作爲載體(tǐ)，又(yòu)稱高分(fēn)子多孔微球。物(wù)質在其表面既存在吸附作用，又(yòu)存在溶解作用。（2）對非極性及極性物(wù)質無有害的吸附活性，拖尾現象小(xiǎo)，極性組分(fēn)也能出對稱峰；（3）由于不存在液膜，無流失現象，熱穩定性好；（4）機械強度和耐腐蝕性較好，系均勻球形，在填充柱色譜中(zhōng)均勻性、重現性好，有助于減少渦流擴散。檢測器的适應性；載氣流速的大(dà)小(xiǎo)。（1）首先應使柱溫控制在固定液的最高使用溫度（超過該溫度固定液易流失）和最低使用溫度（低于此溫度固定液以固體(tǐ)形式存在）範圍之内。（2）提高柱溫，可以改善傳質阻力，有利于提高柱效，縮短分(fēn)析時間，但降低了容量因子和選擇性，不利于分(fēn)離(lí)。一(yī)般的原則是：在使最難分(fēn)離(lí)的組分(fēn)盡可能分(fēn)離(lí)的前提下(xià)，盡量采用較低的柱溫，但以保留時間适宜，峰形不拖尾爲度。（3）柱溫一(yī)般選擇在接近或略低于組分(fēn)平均沸點時的溫。配比：固定液在載體(tǐ)上的塗漬量，一(yī)般指的是固定液與擔體(tǐ)的百分(fēn)比，填充柱的配比通常在5%～25%之間。配比越低，擔體(tǐ)上形成的液膜越薄，傳質阻力越小(xiǎo)，柱效越高，分(fēn)析速度也越快。配比較低時，固定相的負載量低，允許的進樣量較小(xiǎo)。分(fēn)析工(gōng)作中(zhōng)通常傾向于使用較低的配比。進樣量應控制在柱容量允許範圍及檢測器線性檢測範圍之内。進樣要求動作快、時間短；氣化室一(yī)般較柱溫高30~70°C。(1)塔闆理論：增加柱長，減小(xiǎo)柱徑，即增加柱子塔闆數；(2)速率理論：減小(xiǎo)組分(fēn)在柱中(zhōng)的渦流擴散和傳質阻力，可降低塔闆高度。（1）不裝填料阻力小(xiǎo)，長度可達百米的毛細管柱，管徑0.2mm。（2）氣流單途徑通過柱子，消除了組分(fēn)在柱中(zhōng)的渦流擴散。（3）固定液直接塗在管壁上，總柱内壁面積較大(dà),塗層很薄，則氣相和液相傳質阻力大(dà)大(dà)降低。（4）毛細管色譜柱柱效高達每米3000～4000塊理論塔闆，一(yī)支長度100米的毛細管柱，總的理論塔闆數可達104～106。（1）分(fēn)離(lí)效率高：比填充柱高10～100倍；（2）分(fēn)析速度快：用毛細管色譜分(fēn)析比用填充柱色譜速度；（1）塗壁毛細管柱：将固定液直接塗敷在管内壁上。柱制作相對簡單，但柱制備的重現性差、壽命短。（2）多孔層毛細管柱：在管壁上塗敷一(yī)層多孔性吸附劑固體(tǐ)微粒。構成毛細管氣固色譜。（3）載體(tǐ)塗漬毛細管柱：将非常細的擔體(tǐ)微粒粘接在管壁上，再塗固定液。柱效較塗壁毛細管柱高。（4）化學鍵合或交聯毛細管柱：将固定液通過化學反應鍵合在管壁上或交聯在一(yī)起。使柱效和柱壽命進一(yī)步提高。與氣相色譜法相比，液相色譜法不受樣品揮發性和熱穩定性及相對分(fēn)子質量的限制，隻要求把樣品制成溶液即可，非常适合于分(fēn)離(lí)生(shēng)物(wù)大(dà)分(fēn)子、離(lí)子型化合物(wù)，不穩定的天然産物(wù)以及其他各種高分(fēn)子化合物(wù)等。此外(wài)，液相色譜的流動相不僅起到使樣品沿色譜柱移動的作用，而且與固定相一(yī)樣，與樣品分(fēn)子發生(shēng)選擇性的相互作用，這就爲控制和改善分(fēn)離(lí)條件提供了一(yī)個額外(wài)的可變因素。而氣相色譜法采用的流動相是惰性氣體(tǐ)，對組分(fēn)沒有親和力，僅起運載作用。高壓、高速、高效、高靈敏度、高沸點、熱不穩定有機及生(shēng)化試樣的高效分(fēn)離(lí)分(fēn)析方法。高壓輸液系統、進樣系統、分(fēn)離(lí)系統、檢測系統、數據處理系統。流動相使用前必須脫氣。常用的脫氣方法有：低壓脫氣法（電磁攪拌、水泵抽空，可同時加熱或向溶劑吹氮氣）、吹氦氣脫氣法和超聲波脫氣法等。用兩種（或多種）不同極性的溶劑，在分(fēn)離(lí)過程中(zhōng)按一(yī)定程序連續改變流動相中(zhōng)溶劑的配比和極性，通過流動相中(zhōng)極性的變化來改變被分(fēn)離(lí)組分(fēn)的分(fēn)離(lí)因素，以提高分(fēn)離(lí)效果。特點是先加壓後混合。将溶劑用高壓泵增壓以後輸入色譜系統的梯度混合室，加以混合後送入色譜柱。特點是先混合後加壓。在常壓下(xià)預先按一(yī)定的程序将溶劑混合後再用泵輸入色譜柱。良好的密封性，最小(xiǎo)的死體(tǐ)積，最好的穩定性，進樣時對色譜系統壓力、流量影響較小(xiǎo)。色譜柱是實現分(fēn)離(lí)的核心部件。由柱管和固定相組成。柱管爲直型不鏽鋼管。一(yī)般色譜柱長5~30
cm，内徑4~5 mm，凝膠色譜柱内徑3~12 mm，而制備色譜柱内徑則可達25
mm。一(yī)般淋洗溶劑在進入色譜分(fēn)離(lí)柱之前，先通過前置柱。HPLC柱的填料顆粒粒徑一(yī)般約爲3~10 mm，填充常采用勻漿法。色譜柱的發展趨勢是減小(xiǎo)填料粒度和柱徑以提高柱效。作用——用來連續監測經色譜柱分(fēn)離(lí)後的流出物(wù)的組成和含量變化的裝置。紫外(wài)-可見吸收檢測器、光電二極管陣列檢測器、示差折光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器。流動相不與色譜柱發生(shēng)不可逆化學變化，以保持柱效或柱子的保留性質較長時間不變；對待測樣品有足夠的溶解能力；與所用檢測器相匹配；粘度盡可能小(xiǎo)，以獲得較高的柱效；流動相純度要高，價格便宜，毒性小(xiǎo)。（1）按固定相承受壓力分(fēn)：剛性固體(tǐ)：以二氧化矽爲基質，可承受較高壓力，表面可鍵合各種功能官能團---鍵合固定相，是目前應用最廣泛的固定相。硬膠：主要用于離(lí)子交換色譜法和凝膠色譜法中(zhōng)，由聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯而成，可承受的壓力較低。（2）按孔隙深度分(fēn)：表面多孔型：基體(tǐ)是球形玻璃珠，在玻璃表面塗覆一(yī)層多孔活性物(wù)質如矽膠、氧化鋁、聚酰胺、離(lí)子交換樹(shù)脂、分(fēn)子篩等。優點：适用于快速分(fēn)離(lí)、填充均勻緊密、機械強度高、能承受高壓，适于簡單的樣品及常規分(fēn)析。全多孔型：由矽膠顆粒聚集而成，比表面積大(dà)，柱容量大(dà)，小(xiǎo)顆粒全孔型固定相孔洞淺傳質速率快，柱效高，分(fēn)離(lí)效果好，适合于複雜(zá)樣品、痕量組分(fēn)的分(fēn)離(lí)分(fēn)析，是目前HPLC中(zhōng)應用最廣泛的固定相。是以固體(tǐ)吸附劑爲固定相，吸附劑表面的活性中(zhōng)心具有吸附能力，試樣分(fēn)子被流動相帶入柱内時，它将與流動相溶劑分(fēn)子在吸附劑表面發生(shēng)競争吸附。分(fēn)離(lí)過程是一(yī)個吸附-解吸的平衡過程。通常是矽膠、氧化鋁、活性炭等固體(tǐ)吸附劑。矽膠最常用。流動相：極性大(dà)的試樣需用極性強的洗脫劑，極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。應用：幾何異構體(tǐ)分(fēn)離(lí)和族分(fēn)離(lí)，如農藥異構體(tǐ)；石油中(zhōng)烷、烯、芳烴的分(fēn)離(lí)。不适于強極性的離(lí)子型樣品的分(fēn)離(lí)，不适于分(fēn)離(lí)同系物(wù)（因爲它對相對分(fēn)子質量的選擇性較小(xiǎo)）。根據物(wù)質在兩種互不相溶（或部分(fēn)互溶）的液體(tǐ)中(zhōng)溶解度的不同實現分(fēn)離(lí)。分(fēn)配系數較大(dà)的組分(fēn)保留值也較大(dà)。流動相與固定液應盡量不互溶，或者二者的極性相差越大(dà)越好。根據流動相與固定相極性的差别程度，可将液液色譜分(fēn)爲正相分(fēn)配色譜（流動相極性小(xiǎo)于固定相極性，極性小(xiǎo)的先流出，适于強極性和中(zhōng)等極性組分(fēn)分(fēn)離(lí)）和反相分(fēn)配色譜（流動相極性大(dà)于固定相極性，極性大(dà)的先流出，适于非極性或弱極性組分(fēn)分(fēn)離(lí)）。固定相：由載體(tǐ)和固定液組成。常用的固定液有b,b’-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、角鲨烷等。應用：同系物(wù)組分(fēn)的分(fēn)離(lí)。例：分(fēn)離(lí)水解蛋白(bái)質所生(shēng)成的各種氨基酸，分(fēn)離(lí)脂肪酸同系物(wù)等。化學鍵合固定相是利用化學反應将有機分(fēn)子鍵合到載體(tǐ)表面上，形成均一(yī)、牢固的單分(fēn)子薄層而構成各種性能的固定相。固定相不易流失，柱的穩定性和壽命較高；能耐受各種溶劑，可用于梯度洗脫；表面較爲均一(yī)。沒有液坑，傳質快，柱效高；能鍵合不同基團以改變其選擇性。例如，鍵合氰基、氨基等極性集團用于正相色譜法，鍵合離(lí)子交換基團用于離(lí)子色譜法，鍵合C2，C4，C6，C8，C18，C16，C18，C22烷基和苯基等非極性基團用于反相色譜法等。因此，它是HPLC較爲理想的固定相。離(lí)子交換色譜法的固定相是離(lí)子交換樹(shù)脂，流動相是水溶液，它是利用待測樣品中(zhōng)各組分(fēn)離(lí)子與離(lí)子交換樹(shù)脂的親和力的不同而進行分(fēn)離(lí)的。水的緩沖溶液。陰離(lí)子離(lí)子交換樹(shù)脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離(lí)子離(lí)子交換樹(shù)脂作固定相，采用堿性水溶液；應用：離(lí)子及可離(lí)解的化合物(wù)，氨基酸、核酸等。凝膠色譜法的固定相爲多孔性凝膠類物(wù)質，流動相爲水溶液或有機溶劑，它是根據不同組分(fēn)分(fēn)子體(tǐ)積的大(dà)小(xiǎo)進行分(fēn)離(lí)的。小(xiǎo)分(fēn)子可以擴散到凝膠空隙，由其中(zhōng)通過，出峰最慢(màn)；中(zhōng)等分(fēn)子隻能通過部分(fēn)凝膠空隙，中(zhōng)速通過；而大(dà)分(fēn)子被排斥在外(wài)，出峰最快；溶劑分(fēn)子小(xiǎo)，故在最後出峰。全部在死體(tǐ)積前出峰；可對相對分(fēn)子質量在100-105範圍内的化合物(wù)按質量分(fēn)離(lí)。能溶解樣品且與凝膠相似(潤濕凝膠并防止吸附作用)、粘度小(xiǎo)(增加擴散速度)。常用四氫呋喃、苯、氯仿、水等。21、影響分(fēn)離(lí)的因素與提高柱效的途徑（1）液體(tǐ)的黏度比氣體(tǐ)大(dà)一(yī)百倍，密度爲氣體(tǐ)的一(yī)千倍左右，故降低傳質阻力是提高柱效主要途徑。（3）液相色譜中(zhōng)，不可能通過增加柱溫來改善傳質。（4）恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分(fēn)離(lí)的最直接的因素。（5）流速大(dà)于0.5 cm/s時, H～u曲線是一(yī)段斜率不大(dà)的直線。降低流速，柱效提高不是很大(dà)。但在實際操作中(zhōng)，流量仍是一(yī)個調整分(fēn)離(lí)度和出峰時間的重要可選擇參數。（6）氣相色譜中(zhōng)的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一(yī)樣。但在高效液相色譜中(zhōng)，分(fēn)離(lí)柱的制備是一(yī)項技術要求非常高的工(gōng)作，一(yī)般很少自行制備。
是将待測物(wù)質置于離(lí)子源中(zhōng)電離(lí)形成帶電離(lí)子，讓離(lí)子加速并通過磁場或電場後，離(lí)子将按質荷比（m/z）大(dà)小(xiǎo)分(fēn)離(lí)，形成質譜圖。依據質譜線的位置和質譜線的相對強度建立的分(fēn)析方法稱爲質譜法。準确測定物(wù)質的分(fēn)子量；質譜法是唯一(yī)可以确定分(fēn)子式的方法；根據碎片特征進行化合物(wù)的結構分(fēn)析。質譜法是利用電磁學原理，将待測樣品分(fēn)子解離(lí)成具有不同質量的離(lí)子，然後按其質荷比（m/z）的大(dà)小(xiǎo)依次排列收集成質譜。根據質譜中(zhōng)的分(fēn)子離(lí)子峰（M·+）可以獲得樣品分(fēn)子的相對分(fēn)子質量信息；根據各離(lí)子峰（分(fēn)子離(lí)子峰、同位素離(lí)子峰、碎片離(lí)子峰、亞穩離(lí)子峰、重排離(lí)子峰等）及其相對強度和氮數規則，可以确定化合物(wù)的分(fēn)子式；根據各離(lí)子峰及物(wù)質化學鍵的斷裂規律可以進行定性分(fēn)析和結構分(fēn)析；根據組分(fēn)質譜峰的峰高與濃度間的線性關系可以進行定量分(fēn)析。（1）進樣，化合物(wù)通過汽化引入電離(lí)室；（2）離(lí)子化，在電離(lí)室，組分(fēn)分(fēn)子被一(yī)束加速電子碰撞，撞擊使分(fēn)子電離(lí)形成正離(lí)子；（3）離(lí)子也可因撞擊強烈而形成碎片離(lí)子；（4）荷正電離(lí)子被加速電壓V加速，産生(shēng)一(yī)定的速度v，與質量、電荷及加速電壓有關；（5）加速正離(lí)子進入一(yī)個強度爲B的磁場（質量分(fēn)析器），發生(shēng)偏轉。真空系統、進樣系統、離(lí)子源或電離(lí)室、質量分(fēn)析器、離(lí)子檢測器。若真空度低：大(dà)量氧會燒壞離(lí)子源的燈絲；會使本底增高，幹擾質譜圖；引起額外(wài)的離(lí)子-分(fēn)子反應，改變裂解模型，使質譜解釋複雜(zá)化；幹擾離(lí)子源中(zhōng)電子束的正常調節；用作加速離(lí)子的幾千伏高壓會引起放(fàng)電等。高效重複地将樣品引入到離(lí)子源中(zhōng)并且不能造成真空度的降低。間歇式進樣系統——氣體(tǐ)及低沸點、易揮發的液體(tǐ)；直接探針進樣——高沸點的液體(tǐ)、固體(tǐ)；色譜進樣系統——有機化合物(wù)。作用是使試樣中(zhōng)的原子、分(fēn)子電離(lí)成離(lí)子，其性能影響質譜儀的靈敏度和分(fēn)辨率本領。電子電離(lí)源的特點：電離(lí)電壓：70eV；加一(yī)小(xiǎo)磁場增加電離(lí)幾率；EI源電離(lí)效率高,碎片離(lí)子多，結構信息豐富，有标準化合物(wù)質譜庫；結構簡單，操作方便；樣品在氣态下(xià)電離(lí)，不能汽化的樣品不能分(fēn)析，主要用于氣-質聯用儀；有些樣品得不到分(fēn)子離(lí)子。電離(lí)能小(xiǎo)，質譜峰數少，譜圖簡單；最強峰爲(M+1)+準分(fēn)子離(lí)子峰；不适用難揮發試樣。高能量的Xe原子轟擊塗在靶上的樣品，濺射出離(lí)子流。本法适合于高極性、大(dà)分(fēn)子量、低蒸汽壓、熱穩定性差的樣品。FAB一(yī)般用作磁式質譜的離(lí)子源。噴嘴（金屬毛細管），霧化氣，幹燥氣。原理：噴霧蒸發電壓。特點：ESI是最軟的一(yī)種電離(lí)方式，隻産生(shēng)分(fēn)子離(lí)子，不産生(shēng)碎片離(lí)子；适用于強極性，大(dà)分(fēn)子量的樣品分(fēn)析，如肽，蛋白(bái)質，糖等；産生(shēng)的離(lí)子帶有多電荷，尤其是生(shēng)物(wù)大(dà)分(fēn)子；主要用于液相色譜-質譜聯用儀，既用作液相色譜和質譜儀之間的接口裝置，同時又(yòu)是電離(lí)裝置。12、場緻電離(lí)源(FI)和場解吸電離(lí)源(FD)分(fēn)子離(lí)子峰強；碎片離(lí)子峰少；不适合化合物(wù)結構鑒定。準分(fēn)子離(lí)子峰很強，且碎片離(lí)子少。通常用于飛行時間質譜，特别适合測定多肽、蛋白(bái)質、DNA片段、多糖等的相對分(fēn)子質量。将離(lí)子源産生(shēng)的離(lí)子按質荷比m/z的大(dà)小(xiǎo)分(fēn)開(kāi)。離(lí)子的m/z與R,B, V有關。通過改變磁場可以把不同離(lí)子分(fēn)開(kāi)。在一(yī)定磁感應強度B下(xià)，改變加速電壓V可以使不同離(lí)子先後通過檢測器，實現質量掃描，得到質譜。特點：結構簡單，操作方便；隻有方向聚焦，無能量聚焦，分(fēn)辨率低。實現方向聚焦和能量（速度）聚焦；對于動能不同的離(lí)子，通過調節電場能，達到聚焦的目的。特點：結構簡單，體(tǐ)積小(xiǎo)、重量輕，掃描速率快，适合與色譜聯機。特點：質量範圍寬，掃描速率快，既不需磁場也不需電場，隻需要直線漂移空間。特定m/z離(lí)子在阱内一(yī)定軌道上穩定旋轉，改變端電極電壓，不同m/z離(lí)子飛出阱到達檢測器。質譜一(yī)般可用線譜或表譜兩種方法表示。常用線譜，線譜上的各條直線表示一(yī)個離(lí)子峰，橫坐标爲質荷比m/z，縱坐标爲離(lí)子的相對強度（相對豐度），一(yī)般将原始質譜圖上最強的離(lí)子峰定爲基峰并定爲相對強度100％，其他離(lí)子峰以對基峰的相對百分(fēn)值表示。能夠很直觀地觀察到整個分(fēn)子的質譜全貌，質譜表是用表格形式表示的質譜數據，質譜表中(zhōng)有兩項即質荷比及相對強度。對定量計算較直觀。分(fēn)辨率（R）指質譜儀能區别鄰近兩個質譜峰的能力。對兩個相等強度的相鄰峰，當兩峰間的峰谷不大(dà)于其峰高10％時，則認爲兩峰已經分(fēn)開(kāi)。22、質譜圖中(zhōng)主要離(lí)子峰的類型分(fēn)子離(lí)子峰、同位素離(lí)子峰、碎片離(lí)子峰、亞穩離(lí)子峰、重排離(lí)子峰。分(fēn)子離(lí)子峰的m/z相當于該化合物(wù)的相對分(fēn)子質量。一(yī)般除同位素離(lí)子峰外(wài)，分(fēn)子離(lí)子峰是質譜圖中(zhōng)最大(dà)質荷比的峰，位于質譜圖的最右端。（1）分(fēn)子離(lí)子峰必須符合氮數規則。有機化合物(wù)含有偶數個氮原子或不含氮原子，分(fēn)子離(lí)子峰的m/z一(yī)定是偶數；含奇數個氮原子，分(fēn)子離(lí)子峰的m/z一(yī)定是奇數。（2）分(fēn)子離(lí)子峰與相鄰離(lí)子峰的質量差應合理，如不可能出現比分(fēn)子離(lí)子峰質量小(xiǎo)4～13個質量單位的峰。（3）當化合物(wù)中(zhōng)含S,Br, Cl時，可利用M+·, (M+2) +·等同位素離(lí)子峰的比例來确認分(fēn)子離(lí)子峰。（4）改變質譜儀的操作條件，提高分(fēn)子離(lí)子峰的相對強度。采用化學電離(lí)源或降低電子轟擊源電壓可獲得較強的M+·峰。色譜：化合物(wù)分(fēn)離(lí)，定性能力差。色譜-質譜聯用：共同優點。GC-MS；LC-MS；CE-MS，色譜是質譜的進樣及分(fēn)離(lí)系統；質譜是色譜的檢測器。主要問題：接口技術；除去(qù)色譜中(zhōng)大(dà)量的流動相分(fēn)子。适用範圍：适用于揮發度低、難氣化、極性強、相對分(fēn)子質量大(dà)及熱穩定性差的樣品。
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